Живут в пещерах, в зимний период года впадают в спячку. Слепые с рождения, но прекрасно ориентируются в пространстве за счет эхо-локации.

Большая часть питается насекомыми, однако крупные летучие мыши (например, гигантская вечерница) могут питаться птицами, ящерицами, лягушками, немногие — рыбой, известны летучие мыши, охотящиеся на другие виды рукокрылых.

В Южной Америке существует три вида летучих мышей (вампиры), которые питаются кровью позвоночных — птиц и млекопитающих. Некоторые виды — растительноядные: они питаются, подобно крыланам, фруктами, нектаром или пыльцой (например, листоносы).